亮發(fā)光桿菌的冷凍干燥保藏法

（1）收集菌種：作為長期保藏的菌種，應(yīng)當選擇zui適培養(yǎng)基和溫度以便得到良好的培養(yǎng)物。亮發(fā)光桿菌培養(yǎng)時間要掌握在生長后期，因為對數(shù)生長期的細菌對冷凍干燥的抵抗力較弱，有孢子的微生物需適當?shù)呐囵B(yǎng)以期得到成熟的孢子。大致說，細菌是24~48h，酵母為72h，放線菌和絲狀真菌是7~8天以上。從理論上說，是用生理鹽水或緩沖液將斜面上刮下的菌體或孢子洗幾次，以期洗凈培養(yǎng)基中可能帶來的各種物質(zhì)。但在實際操作中如果洗凈的條件不適宜會使細胞受損，同時也增加了污染的可能性，一般都省略了這一步驟。操作時先將少量分散劑（保護劑）加入斜面中，輕輕刮下菌苔或孢子，注意不要劃破斜面而帶入培養(yǎng)基，也可通過紗布脫脂棉的過濾，制成均勻的懸液。懸液的細胞濃度，因細菌和孢子大小不一，不易訂出統(tǒng)一的標準，細菌可保持在109~1010/ml左右，孢子應(yīng)盡可能分散從而制成20支安瓿管。如果用液體培養(yǎng)，則在離心后除去上清液，每10ml所得的菌體可加入1~2ml的分散劑。這個步驟中必需嚴格的遵守無菌操作和檢驗培養(yǎng)的程度，因保藏期較長，培養(yǎng)物不純或操作污染都會造成不良的后果。制成懸液后即在同樣嚴格的無菌條件下用毛細滴管加入滅菌好的安瓿管中，每個安瓿管裝量約為0.1~0.2ml，但不必準確控制，通常加入3~4滴即可。

（2）安瓿管的準備:冷凍干燥用的安瓿管形狀不一，有的是直形小管，有的在底部帶球形，有一些病原菌更需要在安瓿管內(nèi)再裝入很小的玻璃套以保證安全。安瓿管的內(nèi)徑為8~10mm，長度不小于100mm。安瓿管的玻璃要求中性、能耐熱、耐壓、耐溫度的驟變和管底厚度均勻，先用毛細滴管加入洗液浸泡，第二天用水及蒸餾水洗凈后干燥，瓶口加脫脂棉塞用紙包好，在121℃滅菌30min后，再在60℃烘箱中干燥。干燥溫度不宜過高以防止脫脂棉被烤焦。

（3）冷凍：裝入懸液的安瓿管應(yīng)立即冷凍，不宜放置過久。時間長了會使用菌體自行沉淀成為不均勻的懸液而不利冷凍，同時還會使分散劑起培養(yǎng)基的作用使微生物再次生長或萌發(fā)了孢子，這些情況都不利于長期保藏。冷凍的溫度達到-30℃以下即可，有冷凍干燥機的可在冷凍架上進行，否則用一個盛有干冰的廣口熱水瓶將安瓿管在干冰中轉(zhuǎn)動幾下即可。冷凍后的安瓿管應(yīng)立即真空干燥。

（4）分散劑：分散劑或稱保護劑，其作用有二：一是使懸浮液懸浮其中保持活的狀態(tài)；二是減少冷凍干燥時對微生物引起的損傷。分散劑大致可分為低分子化合物如氨基酸、有機酸、糖類等；高分子化合物如蛋白質(zhì)、多糖等，原則上是二者配合使用的。ATCC及NRRL用馬血清、NCTC用1:3的營養(yǎng)肉湯和馬血清加入7.5%的葡萄糖。亮發(fā)光桿菌常用的是脫指牛乳和血清。zui簡單的是將普通牛乳離心后除去上層乳脂，常壓滅菌3次每次1h，溫度過高將影響保藏的效果。血清要過濾滅菌，牛乳可加熱滅菌且冷凍干燥后易形成均勻粉末故更為常用。

（5）真空干燥：真空干燥可用小箱式的冷凍干燥機，冷凍結(jié)束后立即啟動真空泵，在15min內(nèi)使小箱內(nèi)真空度達到0.5托，1托的真空度約為1mmHg（1mmHg=133.322Pa）以上。隨著真空度上升至0.1托以上，可以升高箱板的溫度，使小箱內(nèi)的溫度升至25~30℃。此時由于升華還在繼續(xù)，樣品不會融化而能達到干燥的目的。如果有后干燥裝置，可以利用油泵進行后干燥，真空箱內(nèi)的真空度可達到0.01托以上，干燥效果更好。干燥完畢后關(guān)閉真空泵、排氣、取出安瓿管將管頸拉細，再裝在多孔管道上抽真空和融封。這種裝置每次可冷凍干燥大量安瓿管，干燥度和真空度都較高，每次需要的時間較長約在10h以上。

（6）離心式冷凍干燥機：另有一種帶離心機的冷凍干燥機，其主要區(qū)別是在真空箱內(nèi)裝有一個可插入安瓿管口棉塞，插入預冷至-30℃~-50℃的小箱內(nèi)離心機上。啟動離心機及真空泵，約15min后真空度達0.1托時，樣品已被冷凍。此時關(guān)閉離心機將樣品抽干，如有加溫裝置，則在關(guān)閉離心機后逐步加溫至25~30℃使樣品加速干燥，這種裝置可在數(shù)小時內(nèi)完成全部過程。它的主要優(yōu)點是在離心作用情況下抽真空，不會產(chǎn)生泡沫而影響冷凍干燥的效果，但是安瓿管數(shù)受離心插*的限制和污染的機會較多，并不常被采用。冷凍干燥的裝置還有鐘罩式等，其基本原理與操作均相同，不一一列舉。

（7）安瓿管的熔封：熔封必須在第二次抽真空情況下，在多孔管道上進行。一般使用二或三個噴嘴的煤氣燈并由空氣壓縮機送入少量氧氣。熔封技術(shù)需很熟練，因為既要達到熔封*無任何泄漏，同時又要求外觀完整均勻。熔封是在棉塞下部安瓿管已拉細處。

（8）標簽：安瓿管的標簽應(yīng)當予以必要的注意，在大量保藏菌種時不允許有任何的差錯?？梢栽跍缇凹尤胗芯⑷掌诘男〖埰?，亮發(fā)光桿菌zui簡單的是在加懸液前加入有菌名、日期的小條膠布。應(yīng)當避免用水溶性的筆來寫標簽。

（9）安瓿管的保藏及影響保藏因素：安瓿管可放在冰箱內(nèi)在4~5℃低溫下保藏。保藏期為5~10年。室溫保藏的效果不佳。影響保藏期的因素很多，菌種、菌齡、冷凍干燥過程中各個環(huán)節(jié)都與之有關(guān)。保藏期和菌種變異關(guān)，在冷凍干燥中主要是由于干燥樣品中含水量的影響。通常含水量在1~3%時較好，5~6%就會相應(yīng)降低，雖然不一定進行含水量的測定，可用目測或真空度來控制，但應(yīng)當引起必要的注意，此法保藏的菌種可以長期保藏菌種的穩(wěn)定，有報道（2）將保藏10年的12個屬的細菌進行生理、生化、血清學的測定而沒有發(fā)生變異，許多用的放線菌生理、生化、血清學的測定而沒有發(fā)生變異，許多用的放線菌等微生物菌種亦都采用這種保藏方法達到長期保存的目的。

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